羊肚菌液体深层发酵工艺优化研究

摘要：为了探讨羊肚菌的液体发酵工艺，优化液体深层发酵培养基的配方。在单因素试验的基础，进行了多因素正交试验。结果表明，羊肚菌的液体深层发酵培养基配方为: 葡萄糖 1.5%、玉米粉1.5% 、蛋白胨 0.3% 、黄豆粉 0.3% 、KH2PO40.3% 、MgSO40.2% 、CaCO30.1% 、VB10.001% ，菌丝生物量达 3.10 g·100mL－ 1; 液体培养条件为 pH 值 6.5 左右、温度 25℃。
羊肚菌( Morehella esculenta( L.) Pers.) ，又名羊肚蘑、羊肚菜等，是极为珍稀的食药两用真菌，属盘菌目( Pezizales) ，羊肚菌科( Morchellaceae) ，羊肚菌属( Morchella)。羊肚菌营养丰富，含丰富的蛋白质、碳水化合物、多种维生素及 20 多种氨基酸。羊肚菌的营养成分，可与牛乳、肉和鱼粉相当，被称为“健康营养食品”羊肚菌既是宴席上的珍品，又是久负盛名的食补良品。羊肚菌多糖是其主要的有效活性成分之一，具有增强肌体免疫力，抗疲劳，抗病毒，抑制肿瘤等诸多作用。
羊肚菌被认为高级营养滋补佳品，近年来由于野生资源的匮乏，而羊肚菌子实体又对生长环境以及繁殖条件的要求十分严格，羊肚菌的人工栽培技术目前还不成熟，因此羊肚菌液体发酵是工业化、集约化生产羊肚菌菌丝的重要途径，获得的菌丝可以作为开发功能食品的原料。优化发酵培养基，是液体发酵的关键工艺，我们对影响深层发酵的培养基及培养条件进行试验，以期获得的发酵培养基和培养条件，从而提高发酵罐发酵水平。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
( 1) 试验菌株。羊肚菌菌株，购自山东济宁食用菌研究所，菌种保存在马铃薯琼脂培养基
( PDA) 上，保藏温度为 4℃。
( 2) 试剂。葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-麦芽糖、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铵等。
( 3) 仪器。全温振荡培养箱、净工作台、电子天平等。
1.2 试验方法
( 1) 基础培养基( 100mL) 。葡萄糖 3.0g、蛋白胨 0.5g、KH2PO40.3g、MgSO40.2g、FeSO40．02g 、ZnSO40.02g，VB11mg。
( 2) 试验方法。试管菌种经过活化，接入 250mL 三角瓶( 培养基装量 100 mL) 在振荡培养箱中培养，转速为 160 r/min，培养温度为 25℃，培养 7天。
( 3) 发酵液中的菌丝生物量测定。10 mL 发酵液 3000 r/min，离心 15min ，用分析天平称重。
( 4) 正交试验设计。
根据单因素试验结果，采用 L18( 37) 正交表对培养基进行正交试验。采用 250 mL 三角瓶( 装液量为 100 mL) ，培养温度25 ℃ ，摇床转速为 160 r·min－ 1，培养 7 天后，检测菌丝产量。选择培养基配方。
2 试验结果与分析
2.1 碳源对菌丝生物量的影响
据文献报道，多种碳源都能被羊肚菌利用作为生长的养分，单糖、双糖都可以作为羊肚菌的碳源。在发酵基础培养基中分别加入 3.0% 的蔗糖、3.0%玉米粉、3.0%可溶性淀粉、3.0% D-麦芽糖、1.5%葡萄糖 +1.5% 玉米粉、1.5% 葡萄糖 +1.5% 可溶性淀粉、1.5% 蔗糖 + 1.5% 玉米粉以取代其中的基础培养基中的碳源葡萄糖，比较其不同碳源对羊肚菌发酵的影响。
处理 6 的 1.5% 葡萄糖 +1.5% 玉米粉的复合碳源效果，观察发现培养第 2 天菌丝体开始萌发，培养 7 天后菌丝体生物量达到3.06 g/100 mL; 玉米粉也是适合羊肚菌生长的碳源组成，培养 7 天后菌丝体生物量达到2.63 g /100 mL。试验表明，复合碳源要比单一碳源好，因为菌丝开始生长需要易被利用的单糖，后面玉米粉因为除了提供碳源外，还可以提供其他的营养成分，所以复合碳源较好。
2.2 氮源对菌丝生物量的影响
氮素是羊肚菌合成氨基酸、蛋白质、核酸和细胞质的主要成分。试验选择了 4 种常见的原料并进行组合作为氮源进行比较，以确定不同的氮源对羊肚菌菌丝体生物量有何种影响，在基础培养基中分别加入0．5%的黄豆粉、0．5%酵母粉、0．5%蛋白胨、0.25% 黄豆粉 +0.25% 蛋白胨、0．25% 黄豆粉 +0．25%酵母粉、0.5%硫酸铵，以取代其中的基础培养基中的氮源蛋白胨。不同的氮源对羊肚菌菌丝体生物量的影响有很明显的差异，以 0.25% 黄豆粉 +0.25% 蛋白胨、0.25% 黄豆粉 + 0.25% 酵母粉作为氮源时，羊肚菌菌丝体生物量较大，为 2.97 g·100 mL－ 1和 2.76 g·100 mL－ 1; 而以低机氮源作为原料时，得到的菌丝体生物量极低，可以得出结论: 羊肚菌对氮源的利用中，有机氮源要优于低机氮源，而有机氮源中，黄豆粉生物量，所以在液体培养羊肚菌黄豆粉是合适的碳源。
2.3 低机盐对菌丝生物量的影响
低机盐是为羊肚菌生长提供必需的矿质元素，是羊肚菌生命活动中必不可少的一类营养物质。以 3%玉米粉、0.5% 蛋白胨、0.3% KH2PO4、0.2% MgSO4、VB11mg ·100mL－ 1为基础培养基，再以 0.1% CaCO3、0.02% ZnSO4、0.02% Fe SO4、0.02% CuSO4作低机盐，组合成 7 组，进行液体培养试验，在 25℃ 和转速为 160 r·min－ 1下培养 7天后，测菌丝生物量。
培养基中Ca2 +对羊肚菌菌丝生长的影响比较大，添加Zn2 +、Fe2 +对菌丝生长有利，Cu2 +对菌丝生长有抑制作用; 从试验结果中可知，CaCO3+ FeSO4+ZnSO4对羊肚菌菌丝生长有利。
2.4 正交试验确定培养基
为确定羊肚菌生长发育的适液体培养基，在单因素试验基础上，综合考虑各因素，以葡萄糖和玉米粉各占 50%为碳源，首先当葡萄糖大部分被利用以后，玉米粉可以继续为菌体分解和利用，羊肚菌对玉米粉利用也较好; 羊肚菌对黄豆粉利用效果较好，所以采用氮源蛋白胨和黄豆粉各占50% 为氮源，同时添加 CaCO3和生长因子 VB1，按L18( 37) 设计正交试验，进行液体培养基的优选试验。每组设置 3 个平行，测定菌丝体的生物量大小，取平值。通过正交试验可得出因素主次顺序 B ＞ D ＞ A ＞ C ＞ F ＞ E，对羊肚菌发酵影响因素的是碳源( 玉米粉) ，小的是低机盐，依次是玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、蛋白胨、生长因子、低机盐。由方差分析可知，碳源( 玉米粉) 对羊肚菌发酵生长的影响显著性明显，具有统计学意义。
实验结果表明，羊肚菌的液体深层发酵培养基配比为: 葡萄糖 1.5%，玉米粉 1.5%，蛋白胨0.3% ，黄豆粉 0.3% ，KH2PO40.3% 、MgSO40.2% 、CaCO30.1% 、FeSO40.02% 、ZnSO40.02% ，VB10.001% 。
2.5 验证试验
对正交试验结果得出的培养基配方，按照正常培养条件进行验证试验，在优条件下重复 3组。在优条件下平行 3 组试验，与理论预测值相差不大，平达 3.10 g·100mL－ 1，表明采用正交设计法优化羊肚菌的液体培养基所得的参数准确可靠，具有很高的实用意义。
2.6 培养条件试验
根据正交试验的培养基配方进行培养条件试验，考察温度和 pH 值对菌丝生物量的影响。
2.6.1 培养温度对菌丝生长的影响
羊肚菌的菌丝生长温度适宜范围为 20 ～ 30℃，菌丝生物量是在 30℃，在适宜温度范围内，随着温度的升高，菌丝生长速度加快; 温度低于 20℃和高于 30℃不适宜羊肚菌菌丝的生长。在显微镜下观测菌丝的生长状况，在 30℃下生长的菌丝比较细弱，在 20 ～ 25℃下菌丝比较粗壮。菌丝生长速度快，因而综合考虑，培养温度以 25℃为宜。
2.6.2 pH 值对菌丝生长的影响
pH 值在 6.0 ～ 7.0 范围内羊肚菌菌丝可生长，适 pH 值为 6.5。pH 值低于适值对菌丝的影响要比高于适值的影响大。若以 pH 值 6.5 为发酵的初始值，则其终点pH 值为 5.4。微生物在培养过程中由于碳源的水解和氧化产生有机酸使培养基 pH 值下降。因此起始 pH 值不能太低，否则影响菌丝的正常生理活动。综上所述，羊肚菌的液体培养条件为 pH 值6.5 左右、温度 25℃ 。

来源：惠合发酵罐厂家

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