Biolog ECO 解析不同产地大曲微生物群落功能多样性特征

摘要：运用 Biolog-ECO 微平板技术研究安徽、四川、山东、湖北四个产地大曲的微生物群落功能多样性。结果表明，不同产地大曲微生物在碳源利用能力、匀性和物种优势度等方面存在较大差异；对 Biolog 数据进行聚类分析显示：相似理化指标的大曲聚为一类，富集有相似的微生物群系。通过实验表明，应用 BIOLOG 微生物鉴定系统可以明确反映大曲微生态的情况，与传统的平板计数法相比，可以更加有效地反映大曲微生物的活性。
大曲是白酒酿造生产中微生物及酶的主要来源，其质量直接关系到出酒率及基酒的质量。造成大曲品质差异的本质原因是大曲中微生物种群及其产生的复合酶体系组成比例差异，故大曲微生物的种类和种群构成重要。因此，研究大曲的微生物群落组成及其在发酵过程中的变化规律，对提高白酒品质具有重要意义，为进一步研究微生物区系对白酒品质的影响奠定基础。早研究大曲微生物群落结构和多样性主要是依赖传统的培养分离法，即将一定浓度的微生物稀释液接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间后，对生长的菌落计数，并借助形态学、培养特征、生理生化特性鉴定种属分类特性。随着人们对微生物生存状态的研究深入，发现常规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性，传统的培养方法仅对占微生物总数的 0.1-10%的可培养微生物进行分析，不能反映微生物在自然状态下的功能。
Biolog ECO 板通过微生物对碳源的利用能力来表征微生物群落代谢多样性和功能多样性，该法初应用于纯种微生物鉴定，1991 年 Garland 和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究。2002 年徐占成和王加辉将代谢指纹技术应用于曲药分析，研究表明新兴的代谢指纹技术不仅可以对曲药性质进行准确的刻画，而且可以具体分析出某种制曲因素（如制曲环境、制曲工艺、制曲原料等）对某类微生物群系在曲药中消长的影响。本文针对四个不同产地的大曲进行微生物群落功能多样性差异研究，解析不同产地大曲微生物群落功能的差异及其对碳源特异的利用情况。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验用曲分别取自安徽、四川、山东、湖北等地酒厂。
1.2 实验仪器
Biolog Gen III Microstation 自动微生物鉴定系统。
1.3 实验方法
1.3.1 大曲菌悬液的制备
将整块大曲粉碎混匀，过四十目筛。准确称取10.0g 绝干曲样加入到装有玻璃珠的 90mL 生理盐水中，摇床 120r/min 震荡 20min，静置 10min 后取上清液 10mL 加入到 90mL 生理盐水中，稍加震荡得到 1∶100 菌悬液。重复前一步骤稀释到菌悬液为 1∶1000。
1.3.2 微生物群落代谢活性测定
将 Biolog ECO 板从冰箱中取出，预热至室温。将稀释 1000 倍的菌液加入 Biolog ECO 板中，每孔加入 150μL。将接种的 Biolog ECO 板置于 30℃恒温培养箱中培养，分别在 24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h，216h，240h 用 Biolog 自动读数仪在 590nm、750nm 下读取吸光度。
1.4 数据处理方法
微生物代谢强度采用平吸光度值（AWCD）来描述，计算公式为：AWCD=[∑（C-R）]/31式中：C 为反应孔的吸光度值；R 为对照孔的吸光度值。采用 McIntosh 指数、Shannon 指数、Simpson 指数、Shannon 度和 McIntosh 度来描述微生物群落多样性指数，计算方法参照杨永华等的计算方法。采用不同培养时间的数据计算会产生不同的结果，本实验采用培养 96h 的数据计算微生物群落的多样性指数，并用 SPSS21.0 软件进行聚类分析。
2 结果分析
2.1 微生物群落代谢活性的变化
Biolog ECO 板是 Ecology 的简称，Biolog 公司专门研发 ECO 板用于生态研发，常见的用途是用于土壤微生物的功能多样性研究。ECO 板含 31 种碳源，3 组平行，碳源大致分为六大类：单糖、糖苷及聚合糖类，氨基酸类，醇类，酯类，酸类和胺类。大曲微生物随培养时间的变化平吸光度值AWCD 变化。不同产地大曲及同一产地不同种类大曲微生物群落的 AWCD 值在整个培养过程中有比较明显的差异。随着培养时间的增加，各大曲微生物利用碳源量整体呈现逐渐增加的趋势，在培养 120h 后平吸光度值逐渐趋于稳定，衰亡期不明显。
不同产地大曲微生物活性从高到底依次为：安徽曲 2x、四川曲 3x、四川曲 2x、安徽曲4x、安徽曲 1x、安徽曲 3x、四川曲 1x、四川曲 4x、山东曲 1x、四川曲 5x、安徽曲 5x和湖北曲 1x。其中安徽曲2x微生物活性，安徽曲 5x和湖北曲 1x微生物活性低。大曲微生物培养 96h 时对不同碳源的平吸光度值。不同大曲微生物对六种碳源利用率的不同，且不同大曲中的微生物的碳源利用率种类不同。安徽曲 1x对酯类的利用率高于其它五类碳源；，安徽曲 2x、3x、4x和 5x是对单糖/糖苷/聚合糖类的利用率高于其它五类碳源；但是安徽曲 5x微生物对碳源的综合利用率远低于其它四种曲。四川曲 1x、3x和 4x对单糖/糖苷/聚合糖类的利用率高于其它五类碳源；四川曲 2x对酯类的利用率高于其它五类碳源；四川曲 5x对单糖/糖苷/聚合糖类和酯类的利用率高于其它四类碳源；湖北曲 1x对单糖/糖苷/聚合糖类的利用率高于其它五类碳源；山东曲 1x对酯类的利用率高于其它五类碳源。
2.2大曲微生物群落功能多样性分析
对微生物群落功能多样性分析，采用生态学中常用的 3 种多样性指数来反映群落内部物种数和微生物群落功能多样性。所采用的3 种多样性指数反映了微生物群落功能多样性的不同侧面，McIntosh 指数是反映微生物群落一性的度量，Shannon 指数表征大曲中微生物群落丰富度，Simpson 指数评估大曲中微生物群落中常见的物种。各大曲样中丰富度相近，群落匀性和常见物种差异较大。
2.3 不同产地大曲微生物代谢指纹数据聚类分析
代谢指纹技术于 1991 年被首次用于微生物群落分析。研究者发现将微生物混合菌液接种到BiologMciroPlate TM，经过一段时间培养后测定其微生物代谢指纹，可以以此弹指分析其微生物群系的特性。这种分析方法已被证实它能有效的区分微生物群系在时间和空间上的变化。在应用生态学研究领域中，MicroPlates 被用于化验一般微生物群系的稳定性以及检测和评估微生物群系的变化情况。
将接种不同大曲菌悬液的 Biolog ECO 板培养96h 生成的数据进行聚类分析，结果形成一个树状图。聚类分析图谱直观显示出不同曲样按照其对不同碳源的利用率，将相似的曲样聚为一类。当聚合水平＞10 时，本次分析的大曲可以分为 6类，类：安徽曲 5x、湖北曲 1x、四川曲 5x、四川曲4x、山东曲 1x，第二类：四川曲 1x，第三类：安徽曲3x、安徽曲 4x，第四类：安徽曲 1x、四川曲 3x，第五类：四川曲 2x，第六类：安徽曲 2x。安徽曲 5x、湖北曲1x和四川曲 5x在较短的距离尺度相聚，而与其他曲样在较大距离尺度相聚，说明这三种曲微生物群系相似性更高。
2.4 不同产地大曲理化指标分析
为验证分类效果，分别测定了曲样的水分、酸度、糖化力、发酵力、粗蛋白、纤维素酶活力和蛋白酶活力，测定方法参考沈怡方《白酒生产技术全书》。
不同类之间的曲样理化指标差异较大，尤其是酸度、糖化力和发酵力；同一类之间聚合越近，两者之间差异越小。安徽曲 5x、湖北曲 1x和四川曲 5x酸度大、糖化力和发酵力低，明显异于其它曲样。安徽曲 2x糖化力和发酵力远高于其它曲样。说明采用 Biolog ECO 数据进行聚类分析得到的代谢指纹数据可以将相近理化指标的曲药归为一类，即同一理化指标等级的曲药富集有相似的微生物群系，而且微生物生存在量上也相近。
来源：惠合发酵罐厂家

发酵设备

Biolog ECO 解析不同产地大曲微生物群落功能多样性特征