农家泡菜发酵液中乳酸菌的研究

摘要：对农家泡菜发酵液中乳酸菌含量和菌种进行分析研究，经倒平板计数检测出农家泡菜发酵液乳酸菌含量为 1.36×107cfu/mL；从农家泡菜发酵液中分离出 4 株乳酸菌菌株，经形态特征、菌落特征和生化特征分析，分别为植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌。
农家泡菜以其营养丰富、味道鲜美、色泽光亮、制作简单而备受青睐。究其机理，是由于泡菜制作过程中乳酸菌发酵产生多种有益物质，降低发酵液中 pH 值，抑制蔬菜中有害菌，使泡菜颇具色香味美质。但农家常在食用泡菜后将发酵液倒掉，造成可循环利用的有益物质浪费。因此，分离鉴定泡菜发酵液中的乳酸菌，研究开发低成本、高质量、微生态的发酵剂和高效、绿色化的抑菌剂是变废为宝的一项重要课题。

1 材料
1. 1 发酵材料与器具
白菜、黄瓜、青椒、苤蓝、胡萝卜、水、碘盐、调料（花椒、大料、茴香、鲜姜、大蒜、大葱、红辣椒、桂皮、豆蔻、黄酒、白酒、红糖、食醋等）、泡菜坛。
1. 2 检测试剂与仪器
水、改良 MC 培养基、结晶紫、酒精、过氧化氢溶液、葡萄糖发酵培养基、可溶性淀粉、PY基础培养基、卢哥氏碘液、石蕊牛乳、多种碳水化合物发酵物等主要试剂；移液管、三角瓶、洗瓶、试管、酒精灯、培养皿、接种杯、接种环、显微镜、比色盘、废液缸、载玻片、恒温培养箱、冰箱等仪器。

2 方法
2. 1 农家泡菜的制作
2.1.1 制作流程
备菜→清洗→晾干→切分→装坛→加调料→注盐水→密封→发酵→成熟
2.1.2 操作要点
a）备菜：备选新鲜、成熟、质厚、低蛀虫和腐烂现象的白菜、黄瓜、青椒、苤蓝、胡萝卜；
b）清洗：剥除蔬菜表面废叶、切除头部、底部或根部后，用清水洗净；
c）晾干：将蔬菜表面的水分晾干；
d）切分：将蔬菜切成 3 cm ×3 cm 的小块；
e）装坛：将切好的蔬菜放入泡菜坛,压实；
f）加调料：把花椒、大料、茴香、鲜姜、大蒜、大葱、红辣椒、桂皮、豆蔻等调料配好，用卫生白纱布包扎好置于泡菜坛，黄酒、白酒、红糖、食醋等调料适量注入泡菜坛；
g）注盐水：把 2 g/100mL～3 g/100mL比例的盐水注入泡菜坛, 至离坛口约 2 cm处；
h）密封：泡菜坛中注满清水, 用坛盖密封；
i）发酵：室温为 18 ℃左右，发酵时间为 5 d；
j）成熟：发酵成熟后及时用于试验。
2.2 农家泡菜发酵液乳酸菌含量的测定
2.2.1 测定流程
泡菜发酵夜样品→稀释→倒平板→培养→检测计量
2.2.2 操作要点
a）样品稀释：发酵成熟后，操作从泡菜坛中吸取 1 mL泡菜发酵夜，移入装有 9 mL 灭菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，然后再吸取 1 mL 稀释液按 10 倍稀释法递增稀释至 10- 5、10- 6、10- 7；
b）倒平板：选择 10- 5、10- 6、10- 7稀释度，每个稀释度作 3 次重复，培养皿注明相应的标签，倒入溶化冷却至 45 ℃左右的改良 MC 培养基，置水平位置，迅速转动平皿使混合匀，冷却成平板；
c）培养：将平皿倒置于 37 ℃恒温箱内培养48 h；
d）检测计量：取出培养皿，观察长出的细小菌落，按常规方法选择 30～300 个菌落平皿进行计算。

3 乳酸菌菌种的分离鉴定
3.1 操作流程
乳酸菌菌种的分离→纯化→鉴定
3.2 操作要点
3.2.1 分离纯化
条件下对平板中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行反复划线分离，得到纯化的单菌落，将各菌株编号，供下一步检测分析使用。
3.2.2 菌种鉴定
首先将得到的纯化菌种进行革兰氏染色、过氧化氢酶和葡萄糖发酵试验, 其次对结果为革兰氏染色阳性、低芽孢、过氧化氢酶阴性、发酵葡萄糖产酸的菌种进行形态特征、菌落特征和生化特征检测分析,主要包括 H2S 试验、明胶液化试验、吲哚试验、淀粉水解试验、石蕊牛乳试验、碳水化合物发酵等试验，后综合试验结果并对照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》确定菌种名称。
a）革兰氏染色：经涂片、晾干、固定、结晶紫染色、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、晾干程序后用油镜观察，深紫色为革兰氏染色阳性菌，红色为革兰氏染色阴性菌。
b）过氧化氢酶试验：用接种环分别将菌落置于洁净试管内，滴加质量分数 3%过氧化氢溶液 2 mL，30 s 内有气泡者为阳性，低气泡者为阴性。
c）葡萄糖发酵试验：将菌落穿刺接种于盛有葡萄糖发酵培养基的试管，37 ℃温箱中培养 24 h，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性，不变或变蓝（紫）为阴性。
d）明胶水解试验：将菌落接种于明胶基础培养基中，37 ℃培养，并备一支未接种的试管作对照，共同置于冰箱中，等待对照管凝固后记录试验结果，反复观察对比多次，如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。
e） H2S 试验：吊一根乙酸铅滤纸条于接种管口，菌落经 48 h 室温培养，滤纸条变黑为阳性反应。
f）吲哚试验：将供试菌株接种于产吲哚的培养液中，37 ℃培养 24 h，向试管中加入吲哚指示剂，观察结果。若培养液上层出现玫瑰红色，说明产生了吲哚，为阳性；若没有玫瑰红色出现，则向其中加入乙醚约 1 mL，震荡混匀，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚指示剂 10 滴，此时若乙醚层出现玫瑰红色，同样说明有吲哚产生，为阳性，反之为阴性。
g）淀粉水解试验：将菌种接种于含有 0.5 g 可溶性淀粉的 PY 基础培养基中，取少许培养液于比色盘中，并备未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液，不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不。
h）石蕊牛乳试验：牛乳中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色。
i）碳水化合物发酵：将被分析菌种接种到含有待测定的糖或醇类碳水化合物的 PY基础培养基试管中，37 ℃培养 24 h，振荡培养。分析检测时取少量培养液于比色盘中，并备未加碳水化合物的 PY 培养液作对照，滴加试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。

4 结果与分析
4.1 农家泡菜发酵液乳酸菌含量的测定
经倒平板计数检测出，农家泡菜发酵液乳酸菌含量为 1.36×107cfu/mL。
4.2 乳酸菌菌种的分离鉴定结果
经平板划线法对菌种的分离纯化，选取其中占优势的 4 株菌进行形态特征、菌落特征和生化特征的鉴定。
根据综上 4 株菌的形态特征、菌落特征、生化特征的试验结果，依据《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，可鉴定 L1 为植物乳杆菌， L2 为短乳杆菌，L3 为肠膜明串珠菌，L4 为戊糖片球菌。

来源：惠合发酵罐厂家

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