美拉德反应风味料制备中底物肽的酶解工艺研究

摘要：本研究以大豆分离蛋白为原料，筛选出合适的内切蛋白酶，并进一步组合 Flavourzyme 酶进行分步水解，考察蛋白酶的酶解条件对水解度（DH）、肽氮率和大豆肽美拉德反应产物（MRPs）的感官呈味特性的影响。结果表明，采用Alcalase 酶与 Flavourzyme 酶双酶分步组合酶解，确定美拉德反应的适呈味底物肽制备的条件为：2000U/g 底物Alcalase 酶在 60℃下水解时间 3h，再加入 80U/g 底物 Flavourzyme 酶于 50℃下继续作用 4h，所制备的大豆肽 DH 和肽氮率分别达 12.43%和 55.58%，其 MRPs 具有较好的风味增强特性。肽是重要的天然食品配料之一，也是重要的风味前体物，能与还原糖经加热处理后产生的风味，可增强食品的滋味。
风味肽是蛋白水解物或一定分子量的小肽与还原糖的美拉德反应产物（MRPs），其呈味核心是美拉德肽，具有较强的风味增强特性，尤其是能显著增强食品的鲜味、醇厚味和持续感，同时也是一些酱油及豆酱类制备的呈味核心物质。风味肽具有较强的风味增强特性，是风味料开发的基础物质。
大豆蛋白是重要的蛋白质来源，营养丰富，具有多种功能特性，广泛应用于食品加工领域。而且大豆蛋白水解物质量稳定，安全性高，是风味肽开发的理想原料。在大豆蛋白酶解过程中，正确选择蛋白酶是工业生产的关键步骤，由于各种蛋白酶的酶切位点、用量与酶解条件的不同，所制备的多肽与氨基酸种类和数量也会不同，对风味肽的香气类型和强度的影响很大。
本研究以大豆分离蛋白为原料，以水解度、肽氮率及综合感官评分为指标，通过筛选蛋白酶的种类和酶解条件，考察不同酶解条件下获得的大豆肽与木糖体系 MRPs 的呈味特性，探索酶解工艺条件对大豆肽在美拉德反应中呈味规律的影响，优化制备美拉德反应的呈味底物肽的工艺条件，以期为美拉德反应风味料的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
大豆分离蛋白；D-木糖；Alcalase2.4 AL、Protamex、Neutrase 和 Flavourzyme 500MG 蛋白酶；Papain 蛋白酶；食盐和味精为食品级，其他化学试剂为分析级。酸度计； LXJ-II 离心沉淀机；油浴设备；冷冻干燥机；阿贝折光仪。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆蛋白的酶解
称取 10.0g 大豆分离蛋白于酶反应器中，加适量的去离子水混匀后配制成大豆蛋白混合溶液，于85℃恒温水浴中热处理 20min，降温至 30-40℃，调节 pH 和温度至蛋白酶的适 pH 和适温度，再加入酶酶解一定时间，然后于 90℃下灭酶 10min，酶解液冷却后于 3000r/min 离心 30min，上清液即为大豆肽溶液。
1.2.2 美拉德反应
取适量已调配成固形物含量为 10%的大豆肽溶液，添加一定量的木糖使终溶液浓度达 11.5%，用 6N NaOH 溶液调节 pH 值至 7.4，转移到 50mL螺旋密封的反应瓶中并将盖旋紧，在带磁力搅拌器的油浴中于 110℃下加热反应 120min，反应结束后迅速采用冰水冷却，反应液用于分析及感官评定，每一反应重复 2-3 次。
1.3 分析方法
1.3.1 蛋白酶活力及蛋白质含量的测定
蛋白酶活力测定方法参考 QB/T1803-93，蛋白质含量的测定方法参见 GB 5009.5-2010。
1.3.2 水解度（DH）的测定
文中的内切蛋白酶筛选水解趋势线采用 pH-stat法，双酶酶解采用甲醛滴定法测定。
1.3.3 肽氮率分析
肽氮率（%）＝上清液中肽氮量原料总氮量，其中上清液肽氮量为酶解物上清液中可溶性氮含量与氨基氮含量之差。
1.3.4 感官评定方法
为了评价大豆肽 MRPs 的风味特征，通过鲜味溶液来进行评定。鲜味溶液由 1.0%MSG 和 0.5%食盐配制而成。各 MRPs 溶液按 0.5%的比例加入鲜味溶液中，60℃恒温水浴加热 10min，进行感官评定。
首先组织六位经验丰富的咸味风味料评定专家（3 男 3 女）分别对各感官指标（鲜味、醇厚味、持续感、焦甜味、酸味和苦味）进行评价，确定各感官评价指标对呈味质量重要程度的权重系数。然后再由经训练过的有咸味风味剂评定经验的六位感官评定员（4 男 2 女）根据所提供的评价指标对样品进行逐项评分，并采用加权处理法计算总分，打分采用 7 分制，将麦芽糊精的对照溶液设定为 3 分，分值越大表明作用效果越强。采用方差分析和 Duncan 多重比较法分析评定员间及样品间的呈味差异显著性。
加权处理及各项指标总得分计算可根据下式进行：P=ni = 1Σaixi
式中：P———总得分；
n———评价指标数目；
a———权重系数；
x———评价指标得分。

2 结果与讨论
2.1 权重系数的确定
各位专家首先确定了该大豆肽 MRPs 在鲜味溶液中的感官评价指标包括鲜味、醇厚味、持续感、焦甜味、酸味和苦味。
鲜味和醇厚味所占的权重较高，而焦甜味和酸味的权重较低，且焦甜味、酸味和苦味对总体风味呈负贡献。
2.2 蛋白酶活力的测定
由于易受贮藏环境条件的影响，蛋白酶的活力通常会有不同程度的降低。为了客观地计算酶的添加量，通常根据其活力来衡量。同时由于酶制剂公司提供的酶活力单位不同，为了比较不同内切蛋白酶的水解效率，本研究先对所选用的各蛋白酶的活力进行了测定。
2.3 内切蛋白酶的筛选
不同的蛋白酶具有不同特异性的作用基团，在蛋白质肽链上的酶切位点不同，导致酶解物的组成、风味和功能特性上存在差异。由于蛋白质酶解过程中，内切酶是主要的作用酶类，合理选择内切酶是酶解过程的关键。在各内切蛋白酶的 pH 和温度下，各酶的添加量为 3000U/g 底物，底物浓度为6%，考察不同蛋白酶种类对水解度 DH（%）变化趋势的影响。
在蛋白酶 Alcalase、Protamex、Neutrase 和 Papain 作用下，随着酶解时间的延长，DH 显著增加，过 40min 后增加幅度减慢，在40min 时四种酶所对应的 DH 分别达 10.84% 、6.84% 、19.01% 和 1.99% 。Alcalase 酶作用下的 DH明显高于其它三种，说明该酶对大豆分离蛋白具有较高的水解能力，结果与一些报道相。
各蛋白酶分别作用 120min 时，各大豆蛋白水解物中的肽氮率差异明显，其中经Alcalase 酶作用后的肽氮率，可达 68.52%。由此可知，蛋白酶 Alcalase 作用时可获得较高的 DH 和肽氮率，是大豆蛋白水解中理想的内切酶。
2.4 双酶水解条件的优化
在所选定的内切酶的基础上，结合 Flavourzyme酶对大豆肽的外切脱苦作用，本研究采用了Alcalase 酶与 Flavourzyme 酶分步水解的方案，考查加酶量和酶解时间对 DH、肽氮率和美拉德反应产物感官效果的影响，确定较佳的酶解条件。
2.4.1 Alcalase 酶添加量的影响
蛋白酶的用量直接影响水解效率，添加量过一定的范围，蛋白质的利用率和酶解效率不会继续增加，同时可能会引起蛋白酶的自溶现象增强，而且增加生产成本，因此确定合适加酶量也是很关键的。
在底物浓度 6%（W/V）、pH 8.0 和 60℃下加入不同量的 Alcalase 酶水解 4h，再于 50℃下加入 80U/g 底物 Flavourzyme 酶继续作用 2h。考察 Alcalase 酶加入量（1000、1500、2000、2500 和 3000U/g 底物）对DH 和肽氮率的变化及各大豆肽 MRPs 感官特性的影响。
（1）酶解液中 DH 和肽氮率的变化
随着 Alcalase 酶加入量的增加，DH 和肽氮率逐渐增大，当加酶量从 1000U/g 底物增加到 2000U/g 底物时，DH 和肽氮率分别增加了14.61%和 15.64%，此后再继续增加酶的用量，两指标变化幅度不大，这可能是由于在低水平的加酶量条件下，酶被底物所饱和，因此随着加酶量的增加，肽氮率迅速增加，当加酶量达到一定值之后，可能由于各蛋白酶间产生了一定的竞争性抑制作用，导致虽然 Alcalase 酶的加入量明显提高，而 DH 和肽氮率却没有较大的变化。
（2）Alcalase 酶添加量对大豆肽 MRPs 感官特性的影响
感官评定员的 Pr 值大于 0.01，而样品的 Pr 值则远小于 0.05，表明感官评定员不存在显著性差异，此次感官评定的数据是有效的。同时酶量对 MRPs 的综合评分在 5％显著性水平上存在显著性差异，进一步通过 Duncan 多重比较法确定各样品的差异程度，样品平数依大小排列：
查表（Duncan’s 新复极差测验的 SSR 值表）得在自由度 dfe＝20 下，P=2、3、4、5 时的 SSR 值，代入下式：LSR＝SSR×SE 计算新复极差测验 LSR 值：进行如下比较：C-E=2.12>LSR5=0.84，C-D=1.69>LSR4=0.82，C-B=1.40>LSR3=0.80，C-A=0.82>LSR2=0.76，A-E=1.30>LSR4=0.82，A-D=0.97>LSR3=0.80，A-B=0.68<LSR2=0.76，B-E=0.62<LSR3=0.80结果可表示如下，C A B D E，后分为四组：C A B D E。由此可知，在 5%显著性水平下，C 样品综合评分，与其他样品间差异显著。因此，Alcalase 酶添加量为 2000U/g 底物时酶解物的MRPs 感官评定效果，同时考虑节约成本和实际效果，选取 2000U/g 底物为 Alcalase 酶加酶量。
2.4.2 Alcalase 酶解时间的影响
在底物浓度 6%（W/V）、pH 8.0、60℃的条件下加入2000U/g 底物 Alcalase 酶水解不同的时间（1h、2h、3h、4h 和 5h），然后再于 50℃下加入 Flavourzyme酶 80U/g 底物继续作用 2h，考察 Alcalase 酶解时间对 DH 和肽氮率的变化以及对各大豆肽 MRPs 感官特性的影响。
（1）酶解液中 DH 和肽氮率的变化
在 Alcalase 酶作用 1h 情况下，DH可达到 9.53%，随着该酶作用时间的延长，DH 继续增加，在 3h 时达到值，DH 可达 11.19%，提高了17.5%，随后水解度不再随时间的延长而增加，产生这种现象主要是由于各种酶有其特异性催化位点，随着水解的进行，该类位点减少。另外，水解过程中蛋白酶可能会失活，以及随着反应产物的大量积累，产生的产物抑制现象，也会导致这种结果。
同时也发现，肽氮率也随着时间的延长而上升，在 1-3h 之间肽氮率的变化幅度较大，3h 时肽氮率已达 57.26%，此后变化幅度变小。在加酶量一定的情况下，酶解初始阶段，底物浓度较高，作用时间不够充分，酶解速率随着作用时间的延长而提高，肽氮率随之上升。但当底物蛋白逐渐被酶解转化之后，产物对底物有抑制作用，酶解速率下降。同时，温度促使酶蛋白变性是随时间而累加的，随着时间的延长，部分酶可能失活也是导致酶解后程速率下降的一个原因。
（2）Alcalase 酶解时间对大豆肽 MRPs 感官特性的影响
感官评定员的 Pr 值大于 0.01，说明感官评定员之间不存在显著性差异，此次感官评定结果有效。而样品的 Pr 值则小于 0.01，表明Alcalase 酶不同作用时间酶解的各大豆肽 MRPs 的综合评分在 5％显著性水平上存在显著性差异。采用 Duncan 多重比较法判断各样品的感官差异程度，结果表示如下：A C D E B，可分为四组：A CD E B。其中，A 样品感官综合评分，与 C 样品间差异不显著，与其它样品间差异显著。由于样品A和样品 C 在感官评分方面差异不大，且考虑到样品C 中肽氮率明显高于样品 A，故选择 3h 为 Alcalase酶的作用时间。
2.4.3 Flavourzyme 酶添加量的影响
在底物浓度 6%（W/V）、pH 8.0、60℃条件下加入 2000U/g 底物 Alcalase 酶水解 3h，再于 50℃下加入不同量的 Flavourzyme 酶继续作用 2h，考察Flavourzyme 酶的添加量（40、80、120、160 和 200U/g底物）对 DH 和肽氮率的变化及各大豆肽 MRPs 的感官特性。
（1）酶解液中 DH 和肽氮率的变化
Flavourzyme 酶加入量从 40U/g 底物提高到 200U/g 底物时，水解度呈直线上升趋势，表明 Flavourzyme 酶加入量对终水解度影响较大。而肽氮率则随着 Flavourzyme 酶加酶量的增加呈现先上升随后逐渐下降的趋势，在 80U/g 底物时达到点为 57.92%。
（2）Flavourzyme 酶添加量对大豆肽 MRPs 感官特性的影响
感官评定员的 Pr 值大于 0.01，表明所选的感官评定员之间差异不显著，感官评定数据有效。同时样品的 Pr 值则远小于 0.05，表明不同 Flavourzyme 酶添加量下的各大豆肽 MRPs 的感官综合评分在 5％显著性水平上存在显著性差异。
通过比较分析各样品间的感官差异程度，结果可表示如下：B D C E A，后分为五组：B D C E A，各样品间差异显著，其中 B 样品综合评分。由此可知，80U/g 底物的加酶量下酶解出的大豆肽的MRPs 感官评价，且具有的肽氮率，因此选择 80U/g 底物为 Flavourzyme 酶的合适添加量。
2.4.4 Flavourzyme 酶解时间的影响
在底物浓度 6%（W/V）、pH 8.0、60℃的条件下加入 2000U/g 底物 Alcalase 酶水解 3h，然后在 50℃下加入 Flavourzyme 酶 80U/g 底物继续作用 1、2、3、4和 5h，考察 Flavourzyme 酶的作用时间对 DH 和肽氮率的变化以及对各大豆肽 MRPs 感官特性的影响。
（1）酶解液中 DH 和肽氮率的变化
在所研究的时间范围内，Flavourzyme酶解作用时间对 DH 有显著影响，随着作用时间的延长，DH 增加较快，在 6h 时 DH 可达 13.61%。在Flavourzyme 酶作用前 2h，肽氮率变化较快，过 2h之后，肽氮率变化略有降低，但变化幅度不大。
（2）Flavourzyme 酶解时间对大豆肽 MRPs 感官特性的影响
感官评定员的 Pr 值大于0.01，表明所选的感官评定员之间差异不显著，感官评定数据有效。同时样品的 Pr 值则远小于 0.05，表明 Flavourzyme 酶不同作用时间下获得的各大豆肽的 MRPs 感官综合评分在 5％显著性水平上存在显著性差异。经 Duncan 多重比较法分析得出各样品的差异程度结果可表示如下：D C E B A，后分为四组：D C E B A，其中 D 样品综合评分，与其它样品有显著性差异，因此选择 4h 为 Flavourzyme酶的理想作用时间。

3 结论
3.1 通过研究内切蛋白酶 Alcalase、Protamex、Neutrase、Papain 酶对大豆分离蛋白的酶解作用，根据水解度和蛋白溶出率的高低，确定 Alcalase 酶为大豆分离蛋白水解的酶类。
3.2 采用 Alcalase 酶与 Flavourzyme 酶双酶分步组合酶解，确定美拉德反应的适呈味底物肽制备的条件为：在底物浓度为 6%大豆分离蛋白混合液中，热处理后加入 2000U/g 底物 Alcalase 酶在 60℃下水解时间 3h，再加入 80U/g 底物 Flavourzyme 酶于50℃下继续作用 4h，所制备的大豆肽 DH 和肽氮率分别达 12.43%和 55.58%，其 MRPs 具有较好的风味增强特性。

来源：惠合发酵罐厂家

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