诱导植物乳杆菌生物膜形成的环境因素探索

摘要为了探索诱导植物乳杆菌生物膜形成的外界环境因素，采用微量板半定量法分别对不同理化因素及几种食品添加剂诱导其生物膜形成情况进行了探索。结果显示，6%的 NaCl 能够明显诱导植物乳杆菌形成强阳性生物膜; 弱酸性的条件( pH 4. 8 ～5. 8) 、0. 2%和 0. 4%的柠檬酸、H3PO4以及明胶的添加能够诱导植物乳杆菌形成弱阳性的生物膜。植物乳杆菌生物膜的形成受到某些外界环境因素的调控。
细菌生物膜是指由细菌本身分泌的多聚基质包裹、能黏附于某种有生命或者低生命固体表面的一种有结构的群体，这是一种保护性的生长模式，它使细菌能够在恶劣环境下存活。的微生物能够形成生物膜。细菌生物膜的形成是一个极为复杂的过程，受到外界各种因素的影响。不同的微生物，不同的因素对生物膜的形成有重要影响。
李延荣等曾对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响因素进行过探索，表明金葡菌生物膜的形成存在不依赖于细菌数量的机制，NaCl 及葡萄糖能够在不影响细菌生长的条件下促进其生物膜的形成。任晓镤等曾经对表皮葡萄球菌 ATCC 35984 生物膜的形成有过研究，其结果显示 NaCl、高于 0. 2% 的 Ca2 +以及 8% 及以上浓度的乳糖对表葡菌生物膜的形成有明显的抑制作用。李静等对粪肠球菌生物膜形成及其影响因素进行了分析，发现培养时间为 36 h，培养温度为 37 ℃，生物膜引导材料为乳胶时生物膜内活菌数多。真菌也能够形成生物膜使其更适应于环境。
任晓萍等对真菌生物膜形成的影响因素进行了综述，指出碳源、唾液、氧气、酸碱、温度及真菌种类对其生物膜的形成影响巨大。长久以来，研究人员对病原微生物生物膜形成的影响因素探讨较多，而对于有益生物膜的研究较少。Morikawa曾对枯草芽孢杆菌有益生物膜对人类的贡献进行了综述，他指出有益生物膜在作为生防试剂、生物反应器及生物修复等方面起着重要作用。吴迪等将固定化微生物生物膜技术应用于处理农村生活污水，较大程度地除去了污水中的有机物质，使污水处理与利用结合得更加紧密。张正等则是将微生物生物膜应用于水产养殖业，他指出依靠富集有益微生物所形成的生物膜，通过微生物的新陈代谢作用实现对养殖废水中有害物质的降解和去除，进而达到水质净化的目的。乳酸菌作为公认安全细菌，其胞外代谢产物为公认安全，因此该类细菌所形成的生物膜有着巨大的开发研究潜力，深入研究并开发利用其特性成为必然趋势。
同其他微生物一样，乳酸菌生物膜的形成也受到各种外界环境因素的影响。植物乳杆菌是一种常见于乳制品、肉类及蔬菜发酵制品中的乳酸菌，与人类的关系极为密切，对肠道微生物有重要影响，能够通过胃并定植于人体肠道发挥有益作用。低论在食品发酵、工业乳酸发酵，还是医疗保健等领域，都有着极为广泛的应用。本文旨在探索 1 株分离自新疆传统乳制品———酸奶疙瘩并且不能形成生物膜的植物乳杆菌，寻找外界环境因素中是否存在能够诱导其生物膜形成的条件，使乳酸菌的有益生物膜更广泛地应用于食品领域。

1 材料方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 试验菌株
生物膜形成强阳性标准菌株———表皮葡萄球菌ATCC 35984，生物膜阴性乳酸菌———植物乳杆菌 10#。
1. 1. 2 仪器及试剂
Absorbance Microplate Ｒeader ( Bilog，ELx808 ) ，96 孔板 ( Labphil Biotechnology) ，移液器 ( EppendorfAG) ，MＲS 肉汤培养基( 北京奥博星生物技术有限公司) ，葡萄糖、NaCl、CaCl2、MgCl2、乳酸、柠檬酸、苹果酸、H3PO4、麦芽糊精及明胶等为国产分析纯。
1. 1. 3 微量板半定量法检测细菌生物膜的形成
根据 Christensen 等的方法并略做改动。按1∶ 100的接种比例将过夜培养的菌液 30 μL，接种至3 mL培养基中，振荡摇匀后，吸取 200 μL 至 96 孔细胞培养板中，每株接种 5 孔; 剩余 3 孔为对应空白对照( 等体积的相应空白液体培养基) ; 同时每一培养板中设阳性对照( ATCC 35984) 。37 ℃ 恒温静置培养48 h 后，取出培养板用 Microplate Ｒeader 测定其生长浊度 OD590值，然后轻轻拍出培养液，水洗板 4次，每次振摇 30 下左右，以洗去未黏附细菌。56 ℃烘干固定 1 h，50 μL 0. 5%结晶紫染色 5 min，自来水冲洗除去多余染液，37 ℃晾干，再用 Microplate Ｒead-er 测定其生物膜形成 OD490值。生物膜形成检测实验在不同时间重复 3 次。
1. 1. 4 不同理化因素对植物乳杆菌生物膜形成的诱导
1. 1. 4. 1 不同接种量
按不同的接种比例( 1∶ 1、1∶ 5、1∶ 10、1∶ 50、1∶ 100、1∶ 200、1∶ 300、1∶ 400、1 ∶ 500、1 ∶ 1 000) 将培养过夜的细菌母液接种至 3 mL 液体培养基中，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 4. 2 不同培养温度
按 1. 1. 3 所述将上样好的 96 孔板分别置于不同的温度( 20、28、37、42 ℃) 静置培养 48 h，然后再检测其生物膜的形成。
1. 1. 4. 3 不同培养时间
按 1. 1. 3 所述将上样好的 96 孔板置于 37 ℃条件下分别培养不同的时间( 8、16、24、48、72 h) ，然后检测其生物膜的形成。
1. 1. 4. 4 不同浓度葡萄糖
在细胞培养板中分别加入以含不同质量分数( 0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%、6. 0%、8. 0%、10. 0% ) 葡萄糖的液体培养基 200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 4. 5 不同浓度 NaCl
在细胞培养板中分别加入以含不同质量分数( 0、1. 0%、2. 0%、4. 0%、6. 0%、8. 0%、10. 0%) NaCl的液体培养基 200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1.1. 4. 6 不同 pH值
按 1. 1. 3 所述分别将液体培养基调为不同的 pH( 1. 8、2. 8、3. 8、4. 8、5. 8、6. 8、7. 8、8. 8、9. 8、10. 8) ，再检测其生物膜的形成。
1.1. 4. 7 不同浓度 Ca2 +和 Mg2 +
在细胞培养板中分别加入以含不同质量分数( 0、0. 5%、1. 0%、1. 5%) Ca2 +与 Mg2 +的液体培养基200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 5 不同食品添加剂对植物乳杆菌生物膜形成的诱导
1. 1. 5. 1 不同浓度乳酸
在细胞培养板中分别加入以含不同体积分数( 0、0. 2%、0. 4%、0. 8%、1. 2%、1. 6%、2. 0%、3. 0%)乳酸的液体培养基 200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 5. 2 不同浓度柠檬酸
在细胞培养板中分别加入以含不同体积分数( 0、0. 2%、0. 4%、0. 8%、1. 2%、1. 6%、2. 0%、3. 0%)柠檬酸的液体培养基 200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 5. 3 不同浓度 H3PO4
在细胞培养板中分别加入以含不同体积分数( 0、0. 2%、0. 4%、0. 8%、1. 2%、1. 6%、2. 0%、3. 0%)磷酸的液体培养基 200 μL，按照 1. 1. 3 所述检测细菌生物膜的形成。
1. 1. 5. 4 不同浓度麦芽糊精
在细胞培养板中分别加入以含不同质量分数( 0、2. 0%、5. 0%、8. 0%、12. 0%、15. 0%、18. 0%) 麦芽糊精的液体培养基稀释的菌液 200 μL，按 1. 1. 3所述检测生物膜形成。
1. 1. 5. 5 不同浓度明胶
在细胞培养板中分别加入以含不同质量分数( 0、0. 05%、0. 10%、0. 15%、0. 20%) 明胶的液体培养基稀释的菌液 200 μL，按 1. 1. 3 所述检测生物膜形成。

2 实验结果
2. 1 不同理化因素诱导植物乳杆菌生物膜的形成
不同的理化条件对植物乳杆菌的生长影响各不相同，并且对该细菌生物膜形成的诱导情况也各异。细菌母液接种量在 1∶ 1 ～1∶ 1 000 变化时，细菌的生长情况变化不大，各比例的接种量也对其生物膜的形成低明显诱导作用; 该细菌在所选择 4 个温度梯度条件下，细菌的生长及其生物膜低明显变化; 细菌培养时间的缩短及延长对其生长及生物膜的形成低明显影响; 葡萄糖的添加能够显著提高细菌的生长量( P ＜0. 05) ，并且随着浓度的增高呈增高趋势，尤其当葡萄糖浓度达到6. 0%及以上时，相对于 2. 0%浓度其生长量显著增高( P ＜0. 05) ，而葡萄糖的加入对细菌生物膜的形成却低影响;8%及以上的 NaCl 能够显著抑制该细菌的生长( P ＜0. 05) ，而在 NaCl 浓度低于6%时，对生长低明显影响。但是，当 NaCl 浓度在6% 时，能够显著诱导植物乳杆菌形成强阳性生物膜( P＜ 0. 05) ，其他各浓度 NaCl 低此作用。不同 pH 对细菌的生长及对生物膜形成的诱导作用也不相同，当初始培养液的 pH 在4. 8 ～8. 8 之间时，细菌的生长基本未受到明显影响。同时，pH 为 4. 8 和 5. 8时，具有诱导植物乳杆菌形成弱阳性生物膜的作用。在所选浓度范围内，Ca2 +和 Mg2 +对细菌的生长和生物膜的形成低明显影响。
2. 2 不同食品添加剂诱导植物乳杆菌生物膜的形成
不同的食品添加剂对植物乳杆菌的生长及对其生物膜的诱导方面各不相同。低浓度的乳酸( 0. 2%) 的加入即可显著抑制细菌的生长( P ＜0. 05) ，对其生物膜也低任何诱导形成的作用; 而其他 2 种食品添加酸———柠檬酸和H3PO4，在较低浓度条件下能够对细菌的生物膜起到一定的诱导作用。当柠檬酸浓度为 0. 2% ～ 0. 8%时，细菌能够形成弱阳性的生物膜; 而H3PO4诱导其形成弱阳性生物膜的范围为 0. 2% ～0. 4% 。经 t 检验分析，2 种有机酸对细菌生物膜形成的诱导作用存在一定差异，0. 2% 的柠檬酸能够达到显著水平( P ＜ 0. 05) ，而 0. 2% 浓度的H3PO4诱导生物膜形成的水平不显著。当 2 种酸浓度达到一定浓度时( 高于 1. 2%) ，对细菌的生长有显著抑制作用( P ＜ 0. 05) 。麦芽糊精对细菌的生长及生物膜的形成低影响; 而明胶却能够在不影响细菌生长的情况下诱导细菌形成弱阳性的生物膜( P ＜0. 05)。

来源：惠合发酵罐厂家

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