黑曲霉固体发酵产嗜酸性果胶酶的研究

摘要：从杭州植物园土样中筛选到 1 株高产果胶酶菌株，经鉴定为黑曲霉，命名为黑曲霉 JL15 （As-pergillus niger JL15）。固体发酵条件研究结果表明，以麸皮为主要基质，用橘皮粉替代 10%质量的麸皮可提高果胶酶的产量，其外加碳源、氮源分别以甘油和硫酸铵优，适含水量 60 g/100g，适培养时间72 h ~84 h。黑曲霉果胶酶的 Km为 4.04 mg / mL， vmax为 40.16 μmol / min·mg。
植物性细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成，果胶是一种天然高分子化合物，具有良好的胶凝化和乳化稳定作用，其主链由不同酯化度半乳糖醛酸通过 α-1， 4 糖苷键聚合而成，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链。由于结构复杂，果胶的降解需要多种酶的协同作用，其中为主要的是内切聚半乳糖醛酸酶。细菌、放线菌、酵母和霉菌都能合成果胶酶，但研究和应用较多的是真菌果胶酶。果胶酶主要用于增加果汁产量和澄清度，纺织品的生物脱胶，造纸业的生物制浆和作为饲料添加剂等。
果胶酶水解果胶的主要产物为 β- 半乳糖醛酸、果胶低聚糖（POS）和低分子果胶（MCP），后两者是公认的功能性添加剂。 POS、 MCP 在自然界中分布较广，如水果、蔬菜、竹笋、牛奶和蜂蜜中都含有果胶低聚糖，但含量很低。在工业化生产中，一般是通过降解富含果胶的原料得到。食品中典型的质量的果胶来自于柑橘水果类，柑橘是浙江省产量的水果，果胶资源丰富。本研究利用橘皮配合麸皮作为固体发酵原料，探讨本实验室分离的黑曲霉 JL15 产果胶酶固体发酵适的培养条件，为发酵条件的响应面法优化（RSM）和酶法制备果胶低聚糖提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材料
产果胶酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger JL15）由本实验室从杭州植物园土样中分离并保存。橘皮果胶（Pectin from citrus fruit）、牛血清白蛋白（BSA）， Sigma 公司； D- （+） - 半乳糖醛酸， Fluka公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 黑曲霉固体发酵产果胶酶的基础条件
黑曲霉通过固体发酵（SSF）产果胶酶，基础培养基为：干物质中麸皮 95.00 g/100g、（NH4）2SO43.00 g/100g、 MgSO40.05 g/100g、 K2HPO40.15 g/100g，基础培养基中含水量为 65 g/100g。基础发酵培养基灭菌后接入 1 mL 稀释过的黑曲霉菌液，搅拌匀，30 ℃恒温培养。
1.3 黑曲霉固体发酵产果胶酶的单因素试验
通过单因素试验研究不同橘皮粉替换麸皮，不同氮源（NH4Cl，牛肉膏，酵母粉，豆饼粉），外加碳源（葡萄糖，蔗糖，甘油， β－环糊精， D- 甘露糖， D- 果糖）、含水量（50 g/100g， 60 g/100g，65 g/100g， 70 g/100g）、发酵时间（0 h ~ 96 h，从第24 h 开始，每间隔 12 h 取样一次，测定发酵产物的果胶酶活性）对黑曲霉产果胶酶的影响。
1.4 果胶酶的提取及活性测定
固体发酵产物干燥后，按 1∶80 的质量比加蒸馏水溶解，搅拌匀后， 4 ℃静置 12 h，经过纱布粗滤，然后 10 000 r / min 离心 10 min，上清液即为果胶酶粗酶液。果胶酶活性的测定采用 DNS 法。果胶酶活力单位（U）定义为在适条件下每分钟产生相当于1 μmol 还原糖[（以 D- （+） - 半乳糖醛酸计） ]所需的酶量为 1 个酶活力单位（U）。酶液中蛋白质浓度测定采用 Bradford 法，以牛血清白蛋白为（BSA）标准品。果胶酶的米氏常数（Km），反应速度（vmax）测定采用双倒数作图法。测定设 3 个重复，取平值。

2 试验结果与讨论
2.1 橘皮粉替代不同质量麸皮对果胶酶产量的影响
分别以橘皮粉替代不同质量的麸皮。 10%、 20%麸皮替代量的果胶酶产量分别是对照组（全麸皮）的 114.9％和110％；当橘皮粉替代量高时，果胶酶产量低于对照组。说明用适量的橘皮粉替代麸皮能够提高果胶酶的产量。
2.2 外加碳源对果胶酶产量的影响
分别添加 6 种不同的碳源于培养基中，恒温培养黑曲霉。6 种外加碳源中，甘油、蔗糖对黑曲霉产果胶酶具有明显的促进作用，产量分别是对照组的 139.4%、 145.6%；葡萄糖、环糊精、甘露糖、果糖反而使果胶酶产量降低。
2.3 不同氮源对果胶酶产量的影响
添加低机氮源的产酶效果优于有机氮源，其中（NH4）2SO4，为黑曲霉 JL15 产果胶酶的氮源。
2.4 含水量对果胶酶产量的影响
黑曲霉 JL15 菌株在较高含水量培养基中菌体生长缓慢，果胶酶产量较低，适合黑曲霉 JL15固体发酵产果胶酶的适含水量为 60 g/100g。与Aspergillus awamori 利用葡萄渣为固体发酵基质产果胶酶的适起始水分含量相同；但低于 Aspergillusniger 利用向日葵壳为固体发酵基质产果胶酶的适含水量（65 g/100g）。
2.5 发酵时间对果胶酶产量的影响
黑曲霉 JL15 培养 20 h 左右，培养基表面可见零星白色菌丝， 36 h 培养基表面可见较多的白色菌丝，此时酶活力较低。之后菌丝分化产生孢子，颜色逐渐加深，由浅黄到部分黑褐色，在 60 h ~ 72h 间颜色深化很快，直到变为黑褐色。培养 72 h ~84 h 果胶酶产量达值，此后呈下降趋势，第 90h 时的果胶产量是第 84 h 的 51.6%。
2.6 黑曲霉果胶酶酶促动力学常数
研究得出，黑曲霉果胶酶的 Km为 4.04 mg/mL，vmax为 40.16 μmol / min·mg。本实验室前期研究的枯草芽孢杆菌 JL13 果胶酶的 Km为 1.97 mg / mL， vmax为 12.74 μmol / min·mg。表明黑曲霉果胶酶在酶促动力学常数上与枯草芽孢杆菌果胶酶有较大的差异，黑曲霉果胶酶对果胶的亲合能力低于枯草芽孢杆菌 JL13 果胶酶，但催化能力较高。

来源：惠合发酵罐厂家

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