牛奶中掺入尿素的两种快速检测方法

摘要：建立了对二甲氨基苯甲醛法和亚硝酸盐———格里斯试剂法两种对牛奶中掺入的尿素的快速检测方法。通过对显色剂剂量和酸度等反应条件的研究和选择，确定了两种方法的实验条件。
由于目前鲜奶收购检验采用酒精试验、乳稠计测定比重以及酸度检验等方法，各乳品厂家大部分对原料乳实行“按质论价”时往往以蛋白质为主要检测指标，导致了部分个体养牛户在鲜奶中除掺水外，往往会在鲜奶中加尿素来提高蛋白质含量，直接危害人体健康，导致中毒或潜在危害，同时使乳品加工企业造成巨大的经济损失。因此有必要建立针对鲜奶中掺入尿素的快速检测，以方便收购厂家将掺假鲜奶拒之门外。
对牛奶中尿素的快速测定大多使用显色法，应用的显色剂主要有对二甲氨基苯甲醛、亚硝酸盐———格里斯试剂和丁二酮肟等，由于丁二酮肟与尿素反应速度较慢，且需要加热进行，因此前两种显色方法更适合牛奶中尿素的快速检测。但对二甲氨基苯甲醛法，检出限较高，尿素含量低时显色反应颜色变化不明显；而亚硝酸盐———格里斯试剂法，反应所需时间较长，低法满足快速检测的需要。本文将对尿素与二甲氨基苯甲醛和亚硝酸盐———格里斯试剂的显色反应的环境及影响因素进行考察，以建立两种简便、灵敏的鲜牛奶中尿素的快速测定方法。

1 实验与方法
1.1实验原理
1.1.1对二甲氨基苯甲醛法
对二甲氨基苯甲醛在酸性条件下与尿素反应生成的对二甲氨基甲醛脲为柠檬黄色化合物，因此加入尿素的奶样显黄色，未掺尿素的鲜奶为低色，随尿素量的增加，颜色随之变深，根据颜色的变化可定性检测牛乳中是否掺入尿素。
1.1.2亚硝酸盐———格里斯试剂法
尿素与亚硝酸盐在酸性溶液中发生反应生成氮气逸出，格里斯试剂可与亚硝酸盐发生偶氮反应生成紫红色染料，掺入尿素的牛乳由于亚硝酸盐的消耗而不会显色，而正常牛奶则显紫红色。
1.2原料及试剂
鲜牛奶从当地奶站购买。浓盐酸、对二甲氨基苯甲醛、体积分数95%乙醇、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和酒石酸等试剂为分析纯，实验用水为蒸馏水。
对二甲氨基苯甲醛显色剂：称取1.00g对二甲氨基苯甲醛溶于少量体积分数95%乙醇溶液中，移至100ml容量瓶中加入12ml浓盐酸后，用体积分数95%乙醇溶液定容，备用。
0.04g/100ml亚硝酸钠盐酸溶液：称取40mg亚硝酸钠溶解于少量蒸馏水中，向其中加入50ml盐酸，移至100ml棕色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，保存备用。
格里斯试剂：称取8.9g酒石酸，1.0g对氨基苯磺酸和0.1g盐酸萘乙二胺，在研钵中研细混匀后装入棕色瓶备用。
1.3样品测定
1.3.1对二甲氨基苯甲醛法
取被检奶和正常牛奶各3ml放入试管中，分别加入对二甲氨基苯甲醛显色剂1ml，充分振摇，观察显色情况。与正常牛奶相比掺入尿素的牛奶显黄色。
1.3.2亚硝酸盐———格里斯试剂法
取被检奶3ml放人大试管中，加入0.04g/100ml亚硝酸钠盐酸溶液1.5ml，摇匀，待不产生气泡后（约10min）向试管中加入约0.1g格里斯试剂，观察结果。

2 结果与讨论
2.1对二甲氨基苯甲醛法显色条件的确定
使用对二甲氨基苯甲醛测定尿素的显色反应中，测定液中对二甲氨基苯甲醛的浓度大多在0.5g/100ml-5g/100ml范围内。为考察显色剂中对二甲氨基苯甲醛质量浓度对显色结果的影响，分别选择含二甲氨基苯甲醛质量浓度为0.5g/100ml、1g/100ml、2g/100ml、3g/100ml、4g/100ml显色剂（显色剂中浓盐酸加入量为12ml/100ml，用空白鲜奶和尿素含量为0.5g/100ml的鲜奶进行显色试验。
随着显色剂用量的增加，尿素奶颜色相应增加，但PDAB显色剂本身为浅黄色，PDAB浓度增加，显色剂颜色加深，空白鲜奶的颜色也相应加深，以至与含尿素奶相比颜色变化不明显，显色反应的灵敏度降低。在PDAB质量浓度为1g/100ml时，空白鲜奶的颜色受显色剂影响小，而含尿素奶颜色较深，二者颜色差别较大，因此，本实验确定显色剂中PDAB质量浓度为1g/100ml。
酸性条件可促进PDAB 与尿素反应，本实验在PDAB含量为了1g/100ml的显色剂中加入柠檬酸和不同剂量的浓盐酸，以考察显色剂酸度对显色结果的影响。对空白鲜奶和含0.5g/100ml尿素的鲜奶进行的显色试验。
在对二甲氨基苯甲醛比色法测定尿素的显色溶液体系中，在溶液酸度不足时，显色反应速度较慢，颜色较浅；随着盐酸加入量的增加，反应速度加快，显色剂中浓盐酸加入量达到12ml/100ml后，颜色变化速度已能满足检验要求。使用柠檬酸调节酸度，可以看出不仅反应速度较慢且空白鲜奶颜色较深。根据实验结果终选择显色剂中浓盐酸的加入量为12ml/100ml。在选定实验条件下，对不同尿素含量的牛奶，进行显色实验，确定此方法低检出下限为0.2g/100ml。
2.2亚硝酸盐———格里斯试剂法显色条件的确定
本方法中，牛奶中的尿素先与亚硝酸盐反应放出氮气，如果反应，亚硝酸盐被消耗，加入格里斯试剂后，样品不变色；而如果牛奶中没有尿素或尿素的含量很少时，将仍有大量亚硝酸盐残留在牛奶中，亚硝酸离子与格里斯试剂反应，显紫红色。因此亚硝酸盐加入量与实验的灵敏度有很大关系，亚硝酸盐过大，会使尿素的检出限升高。但亚硝酸盐的加入量也不是越少越好，牛奶为白色乳浊液，对显色有一定遮掩作用，亚硝酸盐加入量过少空白鲜奶显色会不明显。实验在3,ml空白鲜奶中加入浓盐酸和不同剂量的0.04g/100ml亚硝酸钠溶液，反应10min后，加入格里斯试剂，观察颜色。
在3ml空白鲜奶中加入0.04g/100ml亚硝酸钠溶液1.25ml，即500μg亚硝酸钠时，可以明显显色。考虑到亚硝酸钠溶液久置容易氧化，含量降低，因此本实验确定加入0.04g/100ml亚硝酸钠溶液1.50ml。
亚硝酸钠与尿素在酸性条件下可迅速反应，使用浓硫酸调节酸度，浓硫酸氧化性较强，与亚硝酸盐同时加入，会将其氧化。因此本实验使用盐酸作为酸度调节剂，且可以将盐酸与亚硝酸盐配制在一种溶液中同时加入，以简化操作步骤。为了对酸度进行考察，本实验在3ml含尿素鲜奶中，加入含不同量盐酸的0.04g/100ml亚硝酸钠溶液1.5ml，反应10min后，加入格里斯试剂，观察颜色。
盐酸浓度加大可明显加速尿素与亚硝酸盐的反应速度。根据实验结果本实验选择确定亚硝酸钠溶液中浓盐酸的加入量为25ml/100ml，该条件下牛奶中的尿素在10min内即可与亚硝酸钠反应。配制亚硝酸钠盐酸溶液时，为防止亚硝酸钠氧化应将浓盐酸适当稀释后加入。在选定实验条件下，牛奶中尿素的低检出下限为0.1g/100ml，与正常牛奶作对照实验，其结果会更为准确。

来源：惠合发酵罐厂家

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