实时荧光定量 PCR 技术在食源性致病菌检测中的应用

摘要：近年来食源性疾病爆发数量呈上升趋势，食品安全问题已经成为危害人们生命和健康的严重问题，引起了全消费者对食品品质、安全和卫生的关注。实时荧光定量 PCR 技术是在定性 PCR 技术的基础上发展起来的核酸定量技术，灵敏性高、特异性强，实现了对 DNA 模板的定量检测，目前已广泛应用于食品检测领域。本文概述了实时荧光定量 PCR 技术的原理及其在食源性致病菌检测中的应用，并对其应用前景进行了探讨。
食品安全问题是一个公共卫生问题，其中食源性致病菌引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一，引起全社会的关注。目前各国食源性疾病的发生呈上升趋势，据美国 CDC（Cen-ters for Disease Control and Prevention，疾病预防控制中心）统计，在美国 2009 年和 2010 年两年间，共爆发了 243 次由于沙门氏菌引起的食物中毒事件，导致 7089 人感染，占总食源性疾病的 30%。发展中国家食源性疾病发生的情况更为严重，由微生物所致的食源性疾病发病人数约占每年发病总人数的 80%。因此，对食源性致病菌的快速检测技术要求越来越高。
实时荧光定量 PCR （简称 Real-time PCR）技术，是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术，全自动荧光定量 PCR 技术由美国 Appliedbiosystems 公司推出，是一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累情况的实时检测来监测整个 PCR 进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Real-time PCR 技术具有特异性强、准确性高、假阳性低；灵敏度高、可定量检测、误差小；操作简单、自动化程度高、产物的扩增和检测闭管一步完成、交叉和环境机会少等优点，因此，在食源性致病菌检测工作中应用越来越广。本文主要介绍 Real-time PCR 技术原理及其在几种常见食源性致病菌检测中的应用，为食源性致病菌的快速定量检测提供参考。

1 Real-time PCR 技术原理
Real-time PCR 技术是在常规 PCR 基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。加入荧光标记探针的原理为，PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，刚开始时，探针结合在DNA 任意一条单链上，当 PCR 扩增时，Taq 酶的 5′端→3′端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成同步，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。CT 值与起始模板具有一定的关系，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的 CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光染料 SYBR Green I 是荧光定量 PCR 常用的 DNA 结合染料，可以与 DNA 双链结合并发出荧光。加入荧光染料的实验原理为，在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱荧光，一旦与双链 DNA 结合后，其荧光增强到 1000 倍。所以，一个反应发出的荧光信号与出现的双链 DNA 量成正比，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量而定量。该法成本低廉，但 SYBR Green I 荧光染料能与的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针法。

2 Real-time PCR 技术在几种食源性致病菌检测中的应用。
2.1 Real-time PCR 对金黄色葡萄球菌的检测
金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见致病菌，能产生多种毒素，其中肠毒素是引起食物中毒的主要原因。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌，居第二位，占细菌性食物中毒的 33%。
乳及乳制品中金黄色葡萄球菌产生的肠毒素 A是引起乳制品食物中毒的主要原因。唐吉思等根据牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素 A 基因（sea），建立了 sea DNA 的 SYBRGreen I 实时荧光定量 PCR 检测方法，低可检测到 49.5fg/μL（16.5 拷贝）的阳性质粒，标准曲线的相关系数为 0.99。Fusco 等利用金黄色葡萄球菌肠毒素基因组（egc）设计引物，采用TaqMan 探针和 SYBR Green 染料两种方法进行 Re-al-time PCR 快速定量检测生牛奶中的金黄色葡萄球菌，这两种方法对目前已知的 29 株临床和食源性金黄色葡萄球菌 egc 变种菌株、4 株 egc 阴性金黄色葡萄球菌菌株和 37 株种族近似的相关菌株的检测特异性都接近，应用于实际牛奶样品中时，这两种方法比传统方法的检测灵敏度都高，而且实验步骤简单。目前的研究结果显示，Real-time PCR 对金黄色葡萄球菌的检测水平，不仅可以满足食品企业对原料乳质量进行检测的需要，还可以为质量管理部门及时有效地提供检测结果。
近年来金黄色葡萄球菌对鲜肉类比较严重。从 2005 年以来我国廊坊、通州、广州、保定、扬州和四川等省市金黄色葡萄球菌状况调查显示，该菌在鲜肉类的检出率分别为 66.7%、33.33%、26.3% 、21% 、10.96% 和 4.55%。徐德顺等利用金黄色葡萄球菌 femB 基因设计 Real-time PCR 引物，对市售生猪肉、鸡肉等进行检测，在 10 株相关菌株的检测中，金黄色葡萄球菌表现出很好的阳性，其余菌株为阴性；纯菌条件下样品，低检测限为 44CFU/mL，同一样品重复 3 次，CT 值的变异系数＜5%。 Alarcon 等在人为金黄色葡萄球菌的牛肉样品中使用 Real-time PCR 方法进行检测，SYBR GreenI 染料和 TaqMan 探针两种方法检测该菌的低限量为 5×102CFU/2g，并且两种方法比传统方法的检测灵敏度都高。邵美丽等根据GenBank 公布的单增李斯特菌的 hlyA 基因序列和金黄色葡萄球菌的 nuc 基因序列各设计一对引物和一条探针，建立基于 TaqMan 探针的这两种菌的双重 Real-time PCR 检测方法。检测人工染菌的猪肉样品时，单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的低检出限为 102CFU/g。可见，Real-time PCR 方法对肉类食品中金黄色葡萄球菌情况的检测也是有效的。
2.2 Real-time PCR 对大肠杆菌的检测
致病性大肠杆菌包括产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌等。其中大肠杆菌 O157∶H7对人致病性强，它属于肠出血性大肠杆菌，像通常的致病菌一样产生细菌毒素，可引发出血性结肠炎，出血性结肠炎可发展为溶血性尿毒综合症和血小板减少性紫癜，严重者可导致死亡。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）统计在2010 年发生的食源性疾病中，4000 个大肠杆菌的感染者中，大部分都是被大肠杆菌 O157∶H7 感染。
所以，大肠杆菌 O157∶H7 感染已成为食品安全的一个重要问题，严重影响食品安全。常规 PCR 检测大肠杆菌 O157∶H7 的敏感性在102CFU/μL 左右，从细菌 DNA 提取、PCR 到电泳，至少需要 6h 左右。胡慧等根据大肠杆菌 O157∶H7的特异基因 rfbE 设计一对特异引物，利用 Real-time PCR 方法检测大肠杆菌 O157∶H7，整个检测只需要 3h，灵敏度可达 2×101CFU/mL 细菌，而且具有较强的特异性。樊杰等根据 GenBank 中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列 Stx1、Stx2 设计 Re-al-time PCR 引物和探针，然后对分离出的鸡源性肠致病性大肠杆菌 O157∶H7/L1 菌株、临床分离的人大肠杆菌 O157∶H7/L2 菌株同时进行 Real-timePCR 检测，TaqMan 荧光定量 PCR 方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL，比常规 PCR 方法的灵敏度高 106倍。Lee 等根据大肠杆菌 O157∶H7 的 rfbE 基因设计引物，对生菜的大肠杆菌 O157∶H7 进行 Real-timePCR 检测，用皂土包被的活性炭除去生菜中可能存在的 PCR 抑制剂，使检测灵敏度从 1×103CFU/g 降低到 5CFU/g，进一步提高了检测的灵敏度。为了防止 Real-timePCR 检测中因死菌的存在造成的假阳性，Elizaquível 等对新鲜蔬菜中的大肠杆菌 O157∶H7 检测时，用叠氮溴化丙锭（PMA）处理样品；Wang 等检测牛奶中的大肠杆菌 O157∶H7时用脱氧胆酸钠和叠氮溴化丙锭来消除死菌的干扰，灵敏度可达 102CFU/mL。这主要是由于脱氧胆酸钠可以增加微生物膜通透性，有利于代谢产物运输到膜外；PMA 能够透过死菌的细胞膜和 DNA 结合并交联，形成共价碳氮键，抑制死菌 DNA 在 PCR 时的扩增，所以提高了 Real-time PCR 检测的准确性。
2.3 Real-time PCR 对沙门氏菌的检测
据统计大约 10%的禽蛋带致病菌、霉菌等，其中沙门氏菌是主要的禽类致病菌。禽类的肠道和输卵管内存在大量的沙门氏菌，成为沙门氏菌的储存宿主。沙门氏菌对人类和动物的危害极大，能引起人类食物中毒、急性肠胃炎、伤寒和副伤寒等多种疾病，因此，研究食品中沙门氏菌快速、准确的检测方法必要。
梁洪军等根据沙门氏菌 invA 基因序列设计Real-time PCR 引物和探针，采用常规方法提取禽蛋中沙门氏菌 DNA，建立 Real-time PCR 检测方法，结果阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线，其他菌株为模板的样品低扩增曲线，特异性、灵敏度和重现性符合检测方法学要求。张巧艳等也根据沙门氏菌 invA 基因序列设计 SYBRGreen I 荧光定量 PCR 引物，对从市随机抽取的常见 112 份乳制品及从奶牛场抽取的 20 份新鲜牛乳进行 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测，结果显示生乳沙门氏菌检出限为 102CFU/mL，乳制品经增菌后为 1CFU/［25g（mL）］。杜雄伟等利用沙门氏菌 invA 基因序列设计 SYBR GreenI 实时荧光定量PCR 检测肉制品中沙门氏菌的引物，检测下线为101CFU/mL，该方法从核酸提取至检测完成，仅需3h 左右。Real-time PCR 检测沙门氏菌重复性好、准确度高、操作简单，所以是值得推广的高通量检测技术。
2.4 Real-time PCR 对副溶血弧菌的检测
副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性多形态球杆菌，具有嗜盐性，生长在含盐 0.5-8%的环境中，主要存在于海产品，以及含盐分较高的腌肉等肉制品中。副溶血性弧菌可导致食物中毒，会引起腹痛、呕吐、腹泻及水样便等症状，重症型常出现失水、休克，甚至死亡。
覃倚莹等以编码副溶血弧菌 toxR 蛋白的 toxR基因为靶基因建立的 Real-time PCR 方法，能选择
性检测副溶血弧菌，灵敏度可检测到 25 个拷贝的toxR 基因重组质粒，对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为 21CFU/mL 和 210CFU/g。
倪梦丽等根据副溶血弧菌 gyrB 基因设计引物，建立了 Real-time PCR 检测贝类中副溶血弧菌的方法，与传统的检测方法相比较，Real-time PCR 检测贝类的副溶血弧菌更为快速准确。Kim 等利用Real-time PCR 对冻蟹肉、生鱼片及牡蛎中的霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌进行同时检测，灵敏度高，三种弧菌的检出限为 100CFU/g，可以满足对水产品快速检测的需要。
2.5 Real-time PCR 对布鲁氏菌的检测
布鲁氏菌病是由革兰阴性、兼性细胞内寄生的布鲁氏菌属细菌引起的一种人兽共患传染-变态反应性疾病，也是《中华人民共和国传染病防治法》中规定报告的乙类传染病，因此，能否快速、有效地从各种病料中检出布鲁氏菌，对及时控制布鲁氏菌的传播和预防对人的感染十分重要。
高正琴等根据布鲁氏菌基因组中的 16SrRNA 序列设计特异性引物和探针，利用新一代Taqman MGB 探针技术，建立特异敏感的 Real-timePCR 方法，用于布鲁氏菌的快速检测。对采集的 773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测，并与普通 PCR方法进行比较分析。结果显示，建立的 Taqman MGB探针 Real-time PCR 方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性，能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌 DNA，低能够检测到的布鲁氏菌数量为 9.3 拷贝，比常规 PCR 方法的灵敏度高 100倍；而且 Taqman MGB 探针 Real-time PCR 方法比常规 PCR 方法更敏感，能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌 DNA，检测时间仅为 2h。刘志国等根据布鲁氏菌特异性基因 bcsp31、aikb/IS711 和bmei1162/IS711 的部分片段作为靶基因，分别设计探针引物；苏娇等根据布鲁氏菌属 bcsp31 特异性基因设计引物，对牛羊布鲁氏菌进行荧光定量 PCR检测，结果显示，布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号，而与其同源性较高的致病菌未见荧光信号，灵敏度高。目前建立的Real-time PCR 对布鲁氏菌的检测方法具有较好的敏感性、特异性和稳定性，对布鲁氏菌病防控有一定的应用价值。

3 Real-time PCR 技术存在的问题及展望
相对于传统 PCR，Real-time PCR 技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，有效解决了 PCR 和对模板定量不准确等问题。该技术应用于食源性致病菌的检测，具有快速、特异和灵敏的特点，可作为食物中毒等突发公共卫生事件处置和重大活动食品安全保障工作的有效技术支撑。
Real-time PCR 技术突破了传统定量中只能终点检测的局限，并采用管分析、利用电脑分析软件对 PCR 扩增产物的实时动态的监测和自动定量，定量动态范围高达五个数量级，且结果重现性较好，从而提高了检测的灵敏度和精密度。但是Real-time PCR 技术在实际应用中也存在一些问题，Real-time PCR 技术需要的热循环仪器和试剂，检测成本较高；检测的过程中，很多因素都可能导致定量结果出现偏差或假阳性结果。为了提高Real-time PCR 技术检测率，随着研究的深入及试剂的商品化，又发展出一些更完善的检测技术。例如，为了减少假阳性结果的出现，扩增反应前加入DNA 降解酶可消除同源和异源 DNA 背景；使用高保真聚合酶来提高反应的灵敏性，加快反应速度；试剂盒的开发，简化实验程序；通用探针库（UniversalProbe library，UPL）的推出，实现了同一探针对多个基因的检测以及针对同一基因上集中跨内含子检测方式的设计；采用锁定核苷酸（Locked NucleicAcid，LNA）技术合成探针，提高探针的熔点温度，可以识别出单个碱基的错配，增加反应的灵敏度和特异性。快速有效鉴定食源性致病菌死活及检测致病菌总量的方法仍有待于进一步研究和完善，随着对致病菌分子水平上的深入研究，各种致病菌保守序列的不断发现，为建立新的引物及探针提供有力数据，为 Real-time PCR 技术在各领域的应用与普及提供基础条件。

来源：惠合发酵罐厂家

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